大蒜提取物对铜绿假单胞菌生物膜形成的影响

丁荣荣，陈贵堂，杨志萍，王海翔，綦国红*

(中国药科大学工学院，江苏南京，)

摘要：研究了大蒜提取物对铜绿假单胞菌PAO1生物膜形成的影响。通过对铜绿假单胞菌PAO1生物膜以及与生物膜形成相关因素的测定，结果表明大蒜提取物在不影响PAO1生长的浓度条件下，能抑制其生物膜的形成、胞外多糖的产生以及浮游现象；与阿奇霉素具有协同作用。因此，大蒜提取物通过干扰铜绿假单胞菌PAO1群体感应系统来抑制其生物膜的形成，降低与生物膜形成相关特性的表达。

关键词：铜绿假单胞菌；生物膜；大蒜提取物；群体感应抑制

铜绿假单胞菌(Pseudomonasaeruginosa，简称PA)广泛分布于健康人体皮肤、呼吸道和消化道等部位，是人体常见条件致病菌。医院间发生感染的第三大致病菌，可引起多种急性或慢性感染，如肠道慢性炎症、泌尿系统感染、肺炎等疾病。特别是感染后产生的生物膜，对PA菌本身产生保护作用，增加了治疗难度，也促生大量耐药菌株的出现[1]。由于PA菌对多种抗生素的高效耐药性，对于免疫力低下或患有其他病症的患者具有严重的危害。因此，对PA菌致病性和耐药性的研究具有重要意义。

很多革兰氏阴性菌通过群体感应(Quorumsensing，简称QS)方式调控某些特定生理性状的表达，如生物浮游、生物膜的形成、抗菌肽的产生、毒性因子等。即细菌能自发产生、释放特定的小分子物质，并能感知其浓度变化，调节自身特定基因的表达，从而改变群体行为[2]。PA菌的致病性受其QS系统的调节，以扩散性小分子为信号物质调控特定基因表达，涉及细胞毒素、致病因子、生物被膜等一系列细菌特征性表型[3]。因此，通过群体感应抑制(Quorumsensinginhibition，简称QSI)原理来控制PA菌致病性的研究具有广阔的发展前景。其机制不同于目前抗生素控制细菌感染的机制，即不是以抑制或杀灭致病菌为目的，而是通过阻断其群体感应通路来减少致病因子的表达，不会对致病菌生长产生选择压力，不会导致严重的抗药性问题[4]。

群体感应抑制剂广泛分布于自然资源中，包括药用植物、食用果蔬和海藻等。人们熟知大蒜具有抗肿瘤，提高机体免疫力，抗氧化等多种生理活性[5]。而且大蒜在抗感染以及抗菌方面有很好的应用前景[6-8]。但大蒜在群体感应抑制方面的研究目前在国内鲜有报道。

因此，本实验拟研究大蒜提取物对PA菌生物膜形成以及生物膜形成相关因子产生的影响，研究视角不同于已有研究大蒜素对铜绿假单胞菌生物膜及毒力因子表达的影响，为大蒜的进一步开发应用提供理论依据。

1.1菌株

铜绿假单胞菌PAO1，本实验室保藏。

1.2材料与试剂

白皮大蒜购自于当地农贸市场；甲苯(分析纯),上海凌峰化学试剂有限公司；苯酚(分析纯)，国药集团化学试剂有限公司；浓硫酸(分析纯)，南京化学试剂股份有限公司；胰蛋白胨(生物试剂)，北京奥博星生物技术有限责任公司；YEAST，EXTRACTOxoidLtd；吖啶橙(AcridineOrange)，Sigma；注射用阿奇霉素,南京海辰药业股份有限公司。

1.3仪器与设备

HZC-恒温振荡培养箱，苏州太仓实验设备有限公司；Elx多功能酶标仪，美国伯腾仪器有限公司；TU-双光束紫外可见分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司；Microscope、Eclipse80i光学显微镜，日本Nikon；TGL-16G离心机，上海安亭科学仪器厂。

1.4实验方法

1.4.1大蒜提取物的制备

选成熟、干燥的蒜头，去蒂、分瓣、剥皮，用清水漂洗，除去杂质。称取g蒜粒，加mL甲苯，用粉碎机将蒜粒捣成糊状，静置过夜，0r/min离心10min，得上清，加入mL无菌蒸馏水，搅拌混匀，室温静置24h，得水相，无菌过滤，分装，于-18℃保藏，备用。粗提物的质量浓度为1g/mL。

1.4.2对铜绿假单胞菌最小抑菌浓度(MIC)的测定

按文献[9]方法，铜绿假单胞菌PAO1活化后，按1%接种量接种于新鲜LB培养基，37℃，r/min振荡培养至ODnm为0.4。按菌液:提取物比例为9∶1进行混合，大蒜提取物最终质量浓度分别为50、60、70、80mg/mL。对照组为LB培养基。于37℃，r/min振荡培养24h，观察抑制生长的最低浓度。

1.4.3对铜绿假单胞菌生长的抑制作用

按1.4.2方法制备含有不同浓度大蒜提取物的菌液后，分别在0、2、4、6、8、10h时取μL培养液加入96孔板中用酶标仪测定ODnm值，绘制成生长曲线。

1.4.4对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用

1.4.4.1光学显微镜对生物膜的定性观察

按1.4.2方法制备含有不同浓度提取物的菌液，分装于锥形瓶中，将1.5cm×1.5cm的无菌玻璃片置于锥形瓶内，37℃静置培养48h后，弃培养液，添加新鲜LB培养基和提取物后继续静置培养48h。

取出玻璃片，无菌水冲洗表面浮菌，45℃干燥30min。0.2%的结晶紫溶液染色2min。无菌水洗掉多余的染色剂，45℃干燥30min。用光学显微镜观察，拍照，具体参见文献[10-12]。

1.4.4.2对生物膜的定量测定

参照文献[13]按1.4.4.1方法操作，无菌输液管片代替玻璃片。45℃干燥后输液管片用无水乙醇洗脱3min,取μL洗脱液加入96孔板中,酶标仪测nm的吸光度。按式(1)计算抑制率:

抑制率

(1)

1.4.5对成熟生物膜的破坏作用

PAO1按1%比例接种于新鲜LB培养基，培养至ODnm值为0.4，分装于锥形瓶中，将玻璃片置于其中，37℃静置培养20h，加入不同浓度的大蒜提取物。再置于37℃静置培养8h，取出，结晶紫染色，显微镜观察，方法同1.4.4.1。

1.4.6与抗生素的协同作用

按文献[14]，PAO1按1%接种量接种于新鲜LB培养基，培养至ODnm值为0.4后，进行分组实验，对照组不加阿奇霉素，不加提取物；实验组一组加阿奇霉素，加提取物，另一组加阿奇霉素，不加提取物。每组加入等体积菌液，阿奇霉素终质量浓度为10μg/mL或5μg/mL。大蒜提取物终质量浓度60mg/mL。37℃静置培养24h，测定OD值，按公式(1)计算抑制率。

1.4.7对胞外多糖产生的抑制作用

PAO1培养至ODnm值为0.4。分装至锥形瓶里，加入不同浓度的提取物，37℃培养振荡培养20h。取菌液10r/min离心10min，得上清，用无菌水稀释，用苯酚-硫酸法测定胞外多糖[15]。

1.4.8对浮游的抑制作用

按文献[14],在9mL含有1.5%琼脂的LB固体培养基中，加入1mL不同浓度的提取物，混匀后倾注平板，在平板上滴加2μLPAO1培养液，无菌风吹干后于37℃静置培养24h，观察结果。

2.1对铜绿假单胞菌的最小抑菌浓度(MIC)

根据PAO1的生长情况，以及测定培养物的OD值，确定大蒜提取物对PAO1的最小抑菌浓度是为80mg/mL。

2.2对铜绿假单胞菌生长的抑制作用

为进一步确定提取物在MIC浓度下对铜绿假单胞菌生长是否有抑菌作用，对生长曲线进行了测定。由图1可知，提取物在60、70mg/mL质量浓度时对PAO1的生长过程以及最大生长量均无抑制作用，因此选上述浓度进行下一步实验。

图1大蒜提取物对PAO1生长抑制作用Fig.1ThegrowthinhibitionofgarlicextracttoPAO1

2.3对铜绿假单胞菌生物膜形成的抑制作用

提取物对生物膜形成的抑制体现在细胞爬片上细胞密度的减少与膜厚度的降低。由图2可知，随着提取物浓度的升高，所形成的生物膜上的细胞密度随之降低，细胞团块变小，团块数量也随之减少。说明提取物的浓度在不抑制PAO1生长的条件下，对PAO1的生物膜的形成具有抑制作用。

a:对照；b:大蒜提取物浓度60mg/mL；c:大蒜提取物浓度70mg/mL图2大蒜提取物对PAO1生物膜形成的影响(×)Fig.2InfluenceofPAO1biofilmsgrownintheabsenceandpresenceofgarlicextract(×)

为进一步证明提取物对PAO1生物膜产生具有抑制作用，进行了定量测定，由图3可知，提取物浓度为60mg/mL、70mg/mL时，对生物膜形成的抑制率分别为15.2%和24.1%，而且浓度升高，抑制率随之升高。

2.4对成熟生物膜的破坏作用

由图4可知，PAO1正常形成的生物膜经大蒜提取物处理后，随着提取物浓度的增大，生物膜上细胞密度随之减少，特别是70mg/mL处理组的生物膜，细胞之间不再连成一片，说明提取物对PAO1成熟生物膜具有破坏作用。

图3大蒜提取物对PAO1生物膜形成的抑制作用Fig.3InhibitionofgarlicextractonbiofilmformationofPAO1

a:对照；b:大蒜提取物浓度60mg/mL；c:大蒜提取物浓度70mg/mL图4大蒜提取物对成熟生物膜的破坏作用(×)Fig.4Destructionofmaturebiofilmsgrownbygarlicextract

2.5对胞外多糖产生的抑制作用

由于胞外多糖是生物膜结构的重要成分，所以影响生物膜产生的因素也会影响胞外多糖的产生。根据PAO1胞外多糖产生量的测定结果(图5)可知，在测定的浓度条件下，提取物对PAO1胞外多糖的产生均有抑制作用，且70mg/mL的抑制率高于60mg/mL。

图5大蒜提取物对PAO1胞外多糖产生的抑制作用Fig.5InhibitionofEPSproductiontoPAO1bygarlicextract

2.6对浮游的抑制作用

细菌浮游特性也是生物膜形成的重要因素，通过对PAO1浮游特性测定结果(图6)表明,提取物浓度在60mg/mL、70mg/mL时能明显抑制PAO1浮游，抑制率分别为16.42%,17.61%。

图6大蒜提取物对PAO1浮游的抑制作用Fig.6InhibitionofmotilityofPAO1bygarlicextract

2.7与抗生素的协同作用

由于铜绿假单胞菌生物膜的形成对抗生素的抗性增强，给临床治疗带来了困难，因此我们对大蒜提取物与抗生素的协同作用进行了研究。由图7可知，阿奇霉素浓度不管在10μg/mL还是5μg/mL,添加提取物组比不添加提取物组对PAO1生长抑制率都高，说明阿奇霉素和大蒜提取物具有协同作用，二者共同作用能显著抑制PAO1生长，而且阿奇霉素在10μg/mL的抑菌率明显高于5μg/mL。因此在不改变抗生素浓度的条件下，通过使用大蒜提取物，增加了PAO1对抗生素的敏感性。

图7大蒜提取物处理PAO1与抗生素的协同作用Fig.7SynergisticeffectofgarlicextractwithantibioticstoPAO1

本实验研究了大蒜提取物对铜绿假单胞菌生物膜产生的抑制作用。通过对生物膜以及与生物膜形成相关的多个特性的测定来说明这个问题。

首先，大家熟知大蒜具有很强的抑菌作用，通过前期试验对比了水提法与甲苯、水两步提取法的抑菌活性，水提取物的抑菌活性远远高于甲苯、水两步法提取物，群体感应抑制活性的浓度范围也很窄。此结果与文献[4,8]的研究结果是一致的。通过甲苯、水两步法提取，去除了大蒜中的部分抑菌物质，同时保留了其中的群体感应抑制活性物质。根据文献[4]分析，经过上述处理后，群体感应抑制活性物质也存在于甲苯相中，但与水相中是不同的物质，所以也就不难解释本研究测定的各项参数抑制率不是特别高的原因。

本研究测定的2个浓度60mg/mL和70mg/mL，在不影响PAO1生长的情况下对其生物膜的形成具有抑制作用，对成熟生物膜具有破坏作用，说明此种作用不是抑制生长所致，而是由群体感应抑制作用所致。

细菌被自身分泌的胞外多糖包裹，而胞外多糖对生物膜结构的形成至关重要，所以测定胞外多糖也能印证生物膜。而且胞外多糖赋予细菌病原体耐药性，作为保护屏障和防止抗生素进入细菌细胞。与抗生素协同作用也能体现对生物膜的影响[16]。图7表明了大蒜提取物和阿奇霉素具有协同作用。在不提高抗生素浓度的条件下，协同使用大蒜提取物能够增强受试菌的敏感性。浮游与生物膜的联系体现在吸附于细胞的能力上，而且对细菌毒力有一定的影响[17]。图6表明处理组浮游直径明显小于对照组。因此，大蒜提取物通过对铜绿假单胞菌QS系统的干扰，抑制了生物膜的形成以及相关因素的表达。

目前已知大蒜提取物中某些化合物其化学结构与QS系统的信号分子相似[18]，可作为QS系统的抑制剂，竞争性地与QS系统信号分子受体结合，阻断QS的网络，最终导致细菌毒力因子的表达下降。如果能从大蒜提取物中提取出有效的单体，它将可作为抗感染治疗的一种新型药物，为临床解决耐药问题向前推进一步。

DINGRong-rong,CHENGui-tang,YANGZhi-ping,WANGHai-xiang,QIGuo-hong*

(SchoolofEngineering,ChinaPharmaceuticalUniversity,Nanjing，China)

ABSTRACT：TheeffectofgarlicextractonthedevelopmentofbiofilminPseudomonasaeruginosaPAO1wasstudied.ThebiofilmproductionandfactorscorrelatedwiththebiofilmformationinPAO1wereevaluated.Theresultsshowedthatthegarlicextractnotonlyinhibitedthedevelopmentofbiofilm,extracellularpolysaccharideproduction,andmotilitycharacteristic,butalsohadsynergisticeffectwithAzithromycinwhentheconcentrationofgarlicextractdidn’taffectgrowthofPAO1.TheresultssuggestedthatgarlicextractcouldinhibitthedevelopmentofbiofilmandreducetheexpressionoffactorscorrelatedwiththebiofilmformationinP.aeruginosaPAO1byinterferingwiththeirQSsystems.

Keywords：Pseudomonasaeruginosa；biofilm；garlicextract；quorumsensinginhibitor

DOI：10./j.cnki.11-/ts.

第一作者：硕士研究生(綦国红副教授为通讯作者，E-mail：qghbox